Introducción al contraste de fases

Microscopio de contraste de fases
Microscopio de contraste de fases

Las preparaciones sin teñir y por lo tanto transparentes que no absorben la luz se llama “muestras de fases”, ya que alteran ligeramente la luz que pasa a través de ellos, por lo general el contraste de fases retarda 1/4 de longitud de onda con respecto a la luz directa y sin desvío, que pasa a través de una muestra teñida. Desgraciadamente los ojos, como los sensores de las cámaras, no son capaces de apreciar estas diferencias de fase. El ojo humano sólo es sensible a los colores del espectro visible (variaciones en la frecuencia de la luz) o de diferentes niveles de intensidad de luz (variaciones en la amplitud de la onda de luz).

En los objetos de fase, el “punto cero” de la luz pasa a través o alrededor de la muestra sin ninguna desviación. La luz diffractada por el objeto no se reduce en amplitud (como en muestras opacas), pero es “retardada”, lenta (retardo de fase) debido a la función del índice de refracción y el espesor de la muestra. Esta luz difractada, disminuida alrededor de 1/4 de longitud de onda, llega al plano de la imagen con la luz desviada, pero en interferencia, esencialmente disminuida en intensidad. El resultado es que la imagen a nivel del ocular carece de contraste para hacer visible los detalles casi invisibles.

Contraste de fases: configuración
Contraste de fases: configuración

Zernike tuvo éxito en el desarrollo de un método, ahora conocida como microscopía de contraste de fase, que permite obtener imágenes nítidas de objetos transparentes como si fueran muestras opacas.

Una ilustración esquemática de la configuración de un microscopio de contraste de fase se muestra en la figura 1.

El ejemplo muestra un excelente contraste cuando la luz difractada y la luz directa (no desviada) están retardadas 1/2 longitud de onda. El método de fases Zernike consiste en acelerar la luz directa 1/4 de longitud de onda, por lo que la diferencia de onda entre la luz directa y la luz difractada de una muestra transparente es precisamente 1/2 longitud de onda. Como resultado, los dos componentes de la luz (directa y difractada) producen interferencia “destructiva” en el ocular. Este método produce una imagen con detalles más oscuros sobre un fondo más claro. Este tipo se conoce como contraste de fase positiva (Figura 2).

Una segunda opción consiste en la retardación de la luz directa 1/4 de longitud de onda, de éste modo ambas luces (directa y difractada) producen una interferencia “constructiva” en el ocular. Este método produce una imagen con detalles de la muestra más claros sobre un fondo oscuro. Este tipo se conoce como contraste de fases negativo. (Figura 3)

Contraste de fases negativa y positiva
Contraste de fases positiva y negativa

Los accesorios necesarios para la operación en contraste de fase son un condensador para colocado debajo de la platina, equipado con anillos de fases, y un conjunto de objetivos para contraste de fase, cada uno con anillo de fases interno. Incluye también un filtro verde (para aumentar la resolución) y un ocular telescópico de fases (para centrar los anillos).

Las técnicas de microscopía de fase son particularmente útiles con muestras delgadas y repartidas en el campo visual. Existen ciertas limitaciones en esta técnica:

  • Las imágenes de fase están generalmente afectados por aureolas alrededor de la células. Estas aureolas son “artefactos” ópticos, que a veces pueden oscurecer los límites entre muestras adyacentes.
  • Los anillos de fase limitan la apertura numérica del sistema óptico, reduciendo de ese modo la resolución.
  • El contraste de fase no funciona con muestras gruesas, porque las variaciones de fase se producen en las zonas justo por encima o por debajo del plano de enfoque.
  • Las imágenes en contraste de fases pueden aparecen en gris si se utiliza luz blanca o verde si se utiliza un filtro verde.

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